Celle-basert ELISA-protokollen

February 15

Celle-basert ELISA-protokollen


ELISA, eller enzym-linked immunosorbent assay, blir brukt som et diagnostisk verktøy i medisin og i biologisk forskning for å kvantifisere mengden av et bestemt protein. ELISA anvender antistoffer for å påvise protein av interesse og et reagens som produserer en farge. Mengden av farge relatert til mengden av protein.

Cell Culture

Celler bør plasseres i brønnene i en 96-brønns plate med 100 mikro-liter vekstmedium og cellene igjen å stå over natten. Hvis man studerer cellenes reaksjon på en faktor, bør cellene være serum-sultet i 24 timer og deretter stimulert med den faktor som studeres.

Fiksering og primær antistoff

Etter fjerning av mediet, blir cellene behandlet med et fikseringsmiddel, for eksempel tre prosent formaldehyd, eller metanol. Cellemembranen må permeabilisert for å tillate antistoffet å trenge inn i cellen. Permeabilization kan oppnås ved anvendelse av 0,1 prosent Triton, hvis metanol ikke tidligere har vært benyttet. Ikke-spesifikk binding kan forebygges ved bruk av 10 prosent fetalt kalveserum fortynnet i fosfat-bufret saltløsning. Etter fjerning av blokken, kan det primære antistoff anvendes og inkubert i en time.

Sekundære antistoff og Stain

Fjern det primære antistoff, og vask tre ganger. Legg til en sekundær antistoff bundet til et deteksjonsmiddel, så som pepperrot-peroksydase. Inkuberes i en time. Vask. Legg kjemiluminescenssubstrat løsning. Utvikle og skanne plate for fargeintensitet.